▇昆明仟草生物科技有限公司

熊伟李从严张成奇

摘要:本文介绍了几种单方植物提取物及其组合提取物对酪氨酸酶活性抑制的差异，体外实验证实组合物在某些协同机制下对酪氨酸酶活性会呈现更优异的抑制活性，是潜在的皮肤美白活性原料。我们在实验中发现某些提取物单独使用时并未显示明显的酪氨酸酶抑制活性，但与其他提取物复配后却能促进体系的整体活性。上述表明我们可以通过筛选和组合多种天然产物获得更有效的美白原料。

概述

东方女性对亮白肌肤有一种执着的追求，皮肤美白剂是通过作用于皮肤黑色素的形成、代谢途径的某个阶段,能够显著控制、抑制黑色素生成且符合安全要求的物质。酪氨酸酶作为黑色素形成的关键酶在肤色影响因素中占据主导作用，也是目前学术界研究较深入的美白活性靶点。体内的酪氨酸在酪氨酸酶的作用下转化为多巴、多巴醌、多巴色素、5,6-二羟吲哚、吲哚-5,6-醌等,最终转变为色素颗粒。在酪氨酸反应生成黑色素的过程中,酪氨酸酶的催化作用主要发生在酪氨酸转化成多巴和多巴转化为多巴醌这两个反应中。因此,一大类美白剂的作用是通过抑制酪氨酸酶的活性,减少黑色素的生成,从而达到美白的目的[1]。

酪氨酸酶作用方式及其活性抑制机制

酪氨酸酶(Tyrosinase)，简称TYR，是一种铜离子依赖酶，它的活性中心是由两个含铜离子位点构成，在催化过程中，双核铜离子位点以三种形态存在：分别是氧化态（Eoxy）、还原态（Emet）和脱氧态（Edeoxy）。

由图2.催化循环可看出酪氨酸酶的催化活性与其两个铜离子的桥接有直接的相关性；与参与反应的外源性氧化物（氧气等）间接相关。

本文通过一系列体外实验测试了以下几种植物提取物单品与其组合提取物对酪氨酸酶抑制活性[3]的差异，验证了具有抗氧化性[4]与铜离子螯合能力的天然产物对酪氨酸酶在生物体内的催化氧化反应的抑制作用，用以评估组合提取物中各成分的协同美白活性。

1.实验部分

1.1实验材料

黄芩提取物、姜黄提取物、黄杞叶提取物、葡萄皮提取物、黄香楝提取物以及组合提取物来源于昆明仟草生物科技有限公司。酪氨酸酶（BDP）购于博美生物科技有限公司。

1.2酪氨酸酶抑制活性测定

分别取黄芩提取物、姜黄提取物、黄杞叶提取物、葡萄皮提取物以及黄香楝提取物待测样品0.1mL、0.2mL、0.5mL及1.0mL，并用PBS缓冲液（0.1M，pH6.8）补足到1.0mL；取熊果苷溶液（0.1%）0.1mL、0.2mL、0.5mL及1.0mL，并用PBS缓冲液（0.1M，pH6.8）补足到1.0mL，作为阳性对照；加入3mLL-酪氨酸溶液（90μg/mL）于37℃温育15min后，加入酪氨酸酶溶液（U/mL）0.1mL，于37℃下反应25min，于nm下测定其吸光值。每个浓度设置三个平行样，酪氨酸酶抑制率（IRTyr）由下式计算：

1.3还原力活性测定

取组合提取物待测样品0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL，并用PBS缓冲液（0.2M，pH6.6）补足到1.0mL；取Vc溶液（μg/mL）0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL作为阳性对照，并用PBS缓冲液（0.2M，pH6.6）补足到1.0mL。在各组样品中加入1mLPBS缓冲液（0.2M，pH6.6）和1mL铁氰化钾溶液（1%），混匀后，于50℃水浴20min，取出，加入1mL三氯乙酸溶液（10%），混匀；用移液枪取2mL混合液于5mL试管中，加入2mL蒸馏水和0.4mL三氯化铁溶液（0.1%），迅速混匀，于nm下测定其吸光值。每个浓度设置三个平行样，还原力（RP）由下式计算：

1.4螯合铜能力测定

标准曲线的制定：分别取0.1mL，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL无水硫酸铜溶液（1mM），用Hex缓冲液（pH5.0）补足到1.0mL；加入4mL的Hex缓冲液和0.2mLTMM指示剂（5mM），混匀静置10min，以Hex缓冲液校零，测定nm处和nm处的吸光值。以A/A为纵坐标，铜离子浓度为横坐标绘制标准曲线。

取组合提取物待测样品0.05mL，0.1mL，0.15mL，0.2mL，0.25mL，用Hex缓冲液补足到0.25mL，加入0.25mL无水硫酸铜溶液（1mM），室温下放置1h；加入2mL的Hex缓冲液和0.1mLTMM指示剂（5mM），混匀静置10min，以Hex缓冲液校零，测定nm处和nm处的吸光值。

2结果与讨论

2.1酪氨酸酶抑制活性

实验中发现某些提取物如姜黄、黄杞叶，单独使用时并未显示明显的酪氨酸酶抑制活性，但与其他提取物按一定比例复配后在较低添加量下表现出较强的协同抑制效果。一定添加量下其抑制活性未成剂量依赖性，但远高于β-熊果苷。

2.2还原活性

还原力测定时我们选择抗坏血酸（Vc,μg/mL）作为阳性对照，将二者10%添加量即Vc浓度最高时的数据进行比对，发现组合提取物的还原能力呈剂量依赖性，在约6%时达到峰值。在这一添加量下组合提取物的还原能力约10倍于Vc。可有效清除导致酪氨酸氧化的外源或内源性氧化物。

2.3铜离子螯合能力

酪氨酸酶是一种铜离子依赖酶，因此我们推测具备铜离子螯合能力的活性成分可能在铜蛋白AB结合形成酪氨酸酶时与其竞争结合位点而达到抑制其活性的作用。组合提取物对铜离子的螯合能力在添加量2%～10%范围内成剂量依赖性且有良好的线性关系，在实验最小添加量2%时即可达到40%的螯合率。证明了铜离子螯合能力对酪氨酸酶抑制活性影响的可能性。

3结论与展望

我们通过实验证实某些本身不具备明显酪氨酸酶抑制活性的植物提取物经过一定比例的组合后能对其他活性提取物产生较强的协同增效作用。因此，我们可以通过筛选和组合多种天然产物取得更好的产品性能。同时，在选择植物提取物设计化妆品成品配方时能有更多的启示。