金柚幼果膳食纤维对糖尿病小鼠肠道菌群的影响

张浣悠，刘袆帆，肖更生，王琴*

（仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州，）

摘要：本研究采用高通量测序技术分析金柚幼果膳食纤维对糖尿病小鼠肠道菌群的影响。经腹腔注射四氧嘧啶(mg/kg体重)建立糖尿病小鼠模型。将50只小鼠随机分为5组：模型组、总膳食纤维组（TDF组）、可溶性膳食纤维组（SDF组）、不可溶性膳食纤维组（IDF组）、阿卡波糖阳性对照组（ACAR组）。按照0.2mL/10g体重的剂量进行灌胃，连续4周，收集小鼠粪便，采用高通量测序技术对各组小鼠粪便菌群进行分析。结果表明，SDF组菌群丰富度显著提高。门水平上，SDF组与ACAR组的厚壁菌门变化最接近，变形菌门的增加最为明显，同时拟杆菌门丰度减小。在菌群的属水平上面来看，SDF组与ACAR组的志贺氏菌属和副干酪乳杆菌属均明显增加。在本试验条件下，喂养金柚幼果总膳食纤维和可溶性膳食纤维能够增加小鼠肠道菌群的多样性，增加小鼠肠道菌群中有益菌的相对丰度，抑制机会致病菌的生长。因此金柚幼果总膳食纤维和可溶性膳食纤维对小鼠肠道菌群具有调节的作用。

关键词：金柚幼果膳食纤维，糖尿病，肠道菌群，高通量测序

EffectofdietaryfiberfromimmatureGoldenPomeloonintestinalfloraofdiabeticmice

ZhangHuanyou,LiuHuifan,XiaoGengsheng,WangQin*

（CollegeofLightIndustryandFoodSciences，ZhongkaiUniversityOfAgricultureandEngineering，GuangdongGuangzhou，）

Abstract:Theeffectofdietaryfiberofimmaturegoldenpomeloontheintestinalmicrobiotaofdiabeticmicewasanalyzedby16SrDNAhigh-throughputsequencinginthisinvestigation.Diabeticmousemodelwasestablishedbyintraperitonealinjectionofalloxan(mg/kgbodyweight).50micewererandomlydividedinto5groups:modelgroup,TDF(totaldietaryfiber)group,SDF(solubledietaryfiber)group,IDFgroup(insolubledietaryfiber),andACAR(acarbosepositivecontrol)group.Micefeceswerecollectedbygavageatadoseof0.2ml/10gbodyweightfor4consecutiveweeks,andthefecalfloraofeachgroupwasanalyzedbyhigh-throughputsequencingtechnology.TheresultsshowedthatthediversityofSDFgroupwassignificantlyincreased.Atthelevelofphylum,thechangesofFirmicutesintheSDFgroupandtheACARgroupweretheclosest,theincreaseofProteobacteriawasthemostobvious,andtheabundanceofBacteroidetesdecreased.Intermsofthegenuslevelofflora,Esherichia-ShigellaandLactobacillusincreasedsignificantlyinSDFgroupandACARgroup.Undertheconditionsofthisexperiment,feedingthetotaldietaryfiberandsolubledietaryfiberofpomelofruitcouldincreasethediversityofintestinalfloraofmice,increasetherelativeabundanceofbeneficialbacteriaintheintestinalfloraofmice,andinhibitthegrowthofopportunisticpathogens.Therefore,thetotaldietaryfiberandsolubledietaryfiberofpomelofruitcouldregulatetheintestinalfloraofmice.

Keywords:dietaryfiberofimmaturegoldenpomelo;intestinalmicrobiota;diabetihigh-throughputsequencing

[1]

柚子（学名：Citrusmaxima），科为芸香、属为柑橘，果实的形状类似梨形或近似于球形，颜色呈橙色或柠檬黄色[1，2]。柚子的保存期较长，气味口感清新酸甜，含多种维生素、矿物质元素，在《本草纲目》中有记载：柚解滞消食，润发去噪。此外，柚皮还可以抑制多种腐败微生物的生长，在医学上有止咳、化痰、抗炎等功效，还有抗氧化活性。由于种植环境、条件等差异，不同种类的柚子含有的活性物质分子结构、构成等各不相同，决定了不同的功能特性，造成生物活性也有差异[3]。

膳食纤维是食物中各类纤维的统称。人体不能消化吸收膳食纤维，但是由于其特殊的生理特性，膳食纤维在营养学上被作为一种十分重要的营养素[4]。可溶性膳食纤维能有效延缓消化，对糖尿病患者调节胰岛素敏感性、改善胆固醇的排泄等有一定的作用[5]。

肠道菌群是人体肠道系统一个十分重要的组成部分，在人体健康的多种影响因素中，肠道微生物的平衡和组成扮演者至关重要的角色。大量的研究表明，动物肠道中存在着“核心菌群”，具有特定的功能，一旦发生了变化就意味着机体生理状态也会随之发生改变（如瘦胖的变化）。人们在饮食中摄入食物后，不仅需要通过效果系统来对食物进行消化，肠道中大量的微生物也参与这个重要过程，影响着机体的生理活动[6]。只有在数量上、种类上都保持相对稳定时，肠道微生物与宿主之间才能构建起一个较为良好的动态平衡。

实验所用的柚子为梅州沙田柚，在柚子种植中，有大量自然掉落的柚子幼果，自然掉落的柚子幼果皮厚肉少，销售价值大幅下降，在柚子种植中造成大量的经济损失与浪费。本研究采用酶法对金柚幼果中总膳食纤维、水溶性膳食纤维、水不溶性膳食纤维分别进行提取，采用注射四氯嘧啶的方法构建糖尿病小鼠模型。通过16SrDNA对小鼠粪便样品中所有的细菌进行高通量测序，解读微生物群体的多样性、丰富度及群体结构，观察柚子幼果的膳食纤维对糖尿病小鼠肠道菌群的影响，进一步阐明肠道菌群在柚子幼果膳食纤维降糖效果中的基础性作用。

1.材料与方法

1.1实验材料与设备

试验材料选用梅州沙田柚幼果，幼果为同一批次落果，个头大小相仿；BN型四氧嘧啶，bioswamp公司；戊巴比妥钠，merck公司；耐高温α-淀粉酶（U/g），纤维素酶（U/mg），木瓜蛋白酶（U/mg），上海瑞永生物科技有限公司；糖化酶，中性蛋白酶，河南万邦实业有限公司；P型戊巴比妥钠，sigmamerck公司。

型血糖仪，鱼跃公司；J型手术直剪，WA型显微镊，WA型显微剪，金钟公司；MEE/02电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；FD-1D-50真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器公司；HY-标准分样筛，金源筛网；BCD-TGN冰箱，青岛海尔股份有限公司；L离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；DHG-A恒温干燥箱，飞迪科技有限公司；HH-2s数显恒温水浴锅，金坛市科杰仪器厂；榨汁机、密封袋、保鲜纸、一次性培养皿、一次性手套，市售。

1.2实验方法

1.2.1制备膳食纤维样品

将柚子洗净，切成小于4厘米的小块。置于托盘中自然风干一段时间后，用鼓风干燥箱在55℃的条件下烘烤24小时以去除水分。然后经粉碎机粉碎得到柚子粉，储存于-4℃备用。

采用改良的Prosky法(AOAC.29)提取柚子总膳食纤维。称取1g柚子粉放入离心管中，加入30mL去离子水后，混合摇晃一分钟以确保粉末全部浸湿。随后在25℃的条件下，超声波恒温水浴。在此之后在g、20min的条件下进行离心。离心后滤液和残渣分离，各存放于不同的锥形瓶中。

向加入锥形瓶中加入20mL乙酸-乙酸钠缓冲液，在℃条件下恒温水解1h，冷却至室温(25℃)，50℃时加入0.03%的纤维素酶1.5h(pH4.9)。此外，将样品加热至85℃水浴10min，加入木瓜蛋白酶在60℃下(0.06%)水浴30min，冷却至室温后加入四倍体积的95%乙醇沉淀可溶性膳食纤维。沉淀一夜后，过滤，取滤渣冻干备用。

取一定量的柚子粉置于50mL的离心管中，以1：10加入去离子水溶解，然后进行离心分离（转速r/min，时间15min），取沉淀进行酶法处理（α-淀粉酶，加酶量0.6%，70℃，pH5.5，时间80min），然后过滤取滤渣烘干，得到不溶性膳食纤维，取滤渣冻干备用。

1.2.2动物模型的建立

六周龄的昆明小鼠(20.0g±2.0g)先进行习惯性喂养7d，除空白对照组外其它各组小白鼠在禁食24h后，经腹腔注射四氧嘧啶(mg/kg体重)，空白组注射等量生理盐水。36h后禁食12h，通过尾部取血用血糖测试仪测其空腹血糖值，选血糖水平在15mmol/L以上的小白鼠建立糖尿病动物模型。在建模成功后，将符合高血糖水平的小白鼠，按性别、体重随机分组，每组10只，共5组，分别对小白鼠按照0.2mL/10g体重的剂量进行灌胃(实验组分别灌TDF、SDF、水不溶性膳食纤维，空白对照组灌胃等量蒸馏水，阳性对照灌阿卡波糖)。连续4周，每周的第7天称重，实验结束时禁食12h，小鼠眼眶静脉采血。血样于4℃，0r/min离心20min分离血清后置，-20℃保存，待测定各项指标。

1.2.3血糖水平、糖化血清蛋白和胰岛素含量的测定

血糖测定：模型建立成功后，测定各组小鼠空腹血糖(n=4/组)。小鼠灌胃4周，每周第7天结束禁食12小时。然后血液收集他们的轨道静脉，进行离心（0rpm，20min，4°C）。将血清分离并储存于-20℃，使用葡萄糖酶分析试剂盒(Sigma-AldrichCorp.，St.Louis,MO,USA)测定小鼠的空腹血糖水平。

糖化血清蛋白测定：小鼠禁食24小时，取眶静脉血液，离心（rpm，15min），测定GSP。取10μL血清结合毫克显色，轻轻摇动。然后混合在37℃恒温水浴15mi，将混合物摇匀然后将10μL蒸馏水、10μL牛血清白蛋白(BSA)、10μLDMF分别添加到标准组，在nm处测定吸光度。GSP计算公式如下:

mM=1mM×MW()/1,=0.gL-1

CK:空白对照组,SB:标准品对照组

胰岛素浓度测定：使用低范围超敏小鼠胰岛素酶联免疫吸附试验试剂盒测定胰岛素。标准品浓度为横坐标，光密度为纵坐标。标准曲线被绘制在坐标纸上。根据样品的光密度，从标准曲线内插相应的浓度。

1.2.4DNA的提取和测序

在灌胃30天后，收集各组小鼠粪便，置于干燥的无菌离心管中，-20℃的冰箱中保存。

采用粪便基因组DNA提取试剂盒提取各组小鼠粪便样品中微生物的总DNA。所提取的DNA进行PCR扩增及测序。利用细菌16srDNAV4区域通用引物：F（5-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3）和R（5-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3）完成对细菌16SrDNAV4区扩增。25μL反应体系包含：2×PCRmix12.5μL，上、下引物各2.5μL，DNA模板50ng，加入双蒸水定容至25μL。反应条件：98℃预变性30s，98℃变性10s，54℃退火30s，72℃延伸42s，72℃最终延伸10min，共经过35个循环。PCR扩增产物采用AxyPrepPCRCleanupKit回收试剂盒进行回收，对回收后的PCR产物采用QubitdsDNAHSAssayKit在PromegaQuantiFluor荧光定量系统上对文库进行定量，将文库浓度在2nM以上的各上机序列文库梯度稀释后，根据所需测序量按相应比例混合，并经NaOH变性为单链进行上机测序；使用IlluminaMiSeq测序仪进行2xbp的双端测序。

1.2.5数据分析

上机测序完成后，我们得到原始的下机数据，利用overlap将双端数据进行拼接，并进行质控、嵌合体过滤，获得高质量的cleandata。DADA2（DivisiveAmpliconDenoisingAlgorithm）不再以序列相似度进行聚类，而是通过“去重复”（Dereplication，相当于以%相似度聚类）等步骤，进而获得单碱基精度的代表序列，大大提升了数据精确度与物种分辨率。DADA2的核心是去噪，然后使用ASVs(AmpliconSequenceVariants)的概念构建类OTU(OperationalTaxonomicUnits)，获得最终的feature特征表以及特征序列，进一步进行多样性分析、物种分类注释和差异分析等。

以上实验均设置3个平行，结果使用平均值±标准差(mean±SD)的方式表示。采用美国IBM公司SPSSStatistics25软件，进行单因素方差分析(one-wayANOVA)中的邓肯法（Duncan）分析。

2.结果与分析

2.1膳食纤维对高血糖大鼠血糖水平、糖化血清蛋白和胰岛素含量的影响

2.1.1膳食纤维对高血糖大鼠血糖水平的影响

从图2-1可以看出，四氧嘧啶给药后，大鼠血糖明显上升(P＜0.05)，表明大鼠高血糖模型建模成功。样品灌胃4周后，TDF组、SDF组、IDF组、ACAR组血糖值分别从27.35±4.10mmol/L下降至23.20±5.31mmol/L、19.43±4.21mmol/L、28.58±5.36mmol/L、23.55±2.79mmol/L。由此可知，可溶性膳食纤维降血糖效果最强，其次是总膳食纤维和阳性对照组，不可溶性膳食纤维没有降血糖的效果。

图2-1四周后血糖含量

2.1.2膳食纤维对高血糖大鼠糖化血清蛋白含量的影响

糖化血清蛋白的浓度能反映近1～3周血糖的情况，可作为评估糖尿病患者短期血糖波动的可靠指标。由图2-2可以看出，经过四氧嘧啶处理后，大鼠的糖化血清蛋白的浓度从1.49mmol/L升至2.44mmol/L，药物组处理后大鼠糖化血清蛋白的浓度有不同程度的下降，TDF组(1.97±0.08mmol/L)、SDF组(2.03±0.05mmol/L)、IDF组(2.01±0.12mmol/L)与ACAR组(1.83±0.09mmol/L)糖化血清蛋白的浓度比较差异无统计学意义，膳食纤维能有效地、持续地控制糖化血清蛋白的浓度，但不如阿卡波糖效果明显。

图2-2糖化血清蛋白含量

2.1.3膳食纤维对高血糖大鼠胰岛素含量的影响

四氧嘧啶选择性地破坏胰岛细胞，引起的胰岛素分泌障碍，诱发高血糖小鼠。膳食纤维能调节胰岛细胞的胰岛素分泌功能，降低胰岛素含量。与空白对照组(23.79±1.92mU/L)相比，高血糖组(58.95±2.61mU/L)的胰岛素水平明显升高(P＜0.05)。药物处理后，SDF(32.55±3.07mU/L)的效果明显强于TDF(38.36±4.63mU/L)和IDF(38.91±2.72mU/L)，与ACAR组(30.74±1.03mU/L)的效果相近。

图2-3胰岛素含量

2.2膳食纤维对高血糖大鼠肠道菌群的影响

粪便样品原始下机数据经质量控制、嵌合体过滤、拼接后，6个样本总共条序列被测出，每个样本平均条；数据的有效性平均为达83%，均在77%以上，这说明数据的可靠性较强。根据获得的特征值丰度表，计算各分组共有feature的数量，并通过Venn图直观地呈现各分组共有和特有的feature数目。

如图2-4和图2-5可知，图中每个圈代表一个分组，菌群丰富度最高的为SDF组（），其次是TDF组（），明显大大高于空白对照组（73）和糖尿病组（），其中SDF组的菌群丰富度增加尤为明显，IDF组菌群含量处于空白对照组和糖尿病组之间。这说明三种膳食纤维均对糖尿病大鼠的肠道菌群具有一定的调整作用，SDF的增加作用最为明显。在张美玲[7]等人的研究中发现，膳食纤维可改善2型糖尿病患者血糖浓度，提高有益菌丰度。

实验结果显示，SDF组和TDF组的Chao1指数、observedspecies指数、Shannon物种丰富度和分布均匀程度明显大于糖尿病组和空白对照组，且SDF组的相差更为明显，这说明SDF和TDF能够增加糖尿病大鼠肠道菌群的丰富度，并且SDF组的增加更为显著。糖尿病组与ACAR组、SDF组、TDF组的Simpson指数的趋势变化大致相同，说明这几三组的大鼠粪便常见菌群差异不大，这可能是因为由于稀有菌群对Simpson指数的影响较小，常见菌群对Simpson指数的影响较大。通过PCoA分析我们可以看出，糖尿病组与其余组中细菌的组成差异性很大，其中与糖尿病组相差最大的为SDF组，而IDF组和TDF组中细菌组成相似度相对较高。我们可以明显地看见SDF组与ACAR组是最接近的，这也说明了SDF组的效果相对是最明显的。

图2-4花瓣图

图2-5Venn图

2.3肠道菌群物种组成分析

由图2-7可以看出，在门分类水平上，ACAR组和SDF组大鼠肠道菌物种丰富相似度最高；在属分类水平上，除空白对照组，与阳性对照组相似度最高的是TDF组，其次是SDF组。

图2-7（a）显示了各样本细菌在门水平的丰度组成，图2-6展示了大鼠肠道内的主要三种门类的细菌为拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门(Proteobacteria)的各组组成含量，这三种门类的细菌占肠道菌群总构成中的95%以上，其他门类如蓝藻细菌门（Cyanobacteria）、疣微菌门（Verru